Detección del virus del mosaico de la alfalfa en regiones productoras de frejol (Phaseolus vulgaris l.) en Chile (página 2)

Materiales y métodos

El trabajo de
esta investigación se desarrolló en los
invernaderos y laboratorios del Centro Internacional de Agricultura
Tropical en Cali, Colombia, y en el
Centro Regional de Investigación La Platina en Santiago,
como también en prospecciones de campo en cultivos de
frejol en Chile.

El patógeno a identificar se aisló de una
planta de frejol cultivar Tórtola corriente afectada por
amarillamiento foliar intenso, obtenida en la localidad de Los
Tilos, (33º34´ latitud sur y 70º38´
longitud oeste) ubicada a 25 km al sur de Santiago, Región
Metropolitana, y se transmitió mecánicamente, bajo
condiciones controladas en invernadero, a la variedad de frejol
Black Turtle Soup, para su conservación y
propagación.

Para la purificación del patógeno, se
adaptó el método de
Guillaspie y Bancroft (1965). Básicamente, se utilizaron 2
mL de una solución amortiguadora de fosfato de potasio
(KPO4) 0,01 M, pH 7,5 por
gramo de tejido homogeneizado. Al extracto obtenido se le
agregó un volumen igual de
cloroformo y se centrifugó a 8.000 rpm por 10 min. Al
sobrenadante se le adicionó glicol polietileno (PEG) al 6%
y se agitó en frío (5°C) por 2 h antes de
centrifugar a 8.500 rpm durante 10 min. El precipitado resultante
se resuspendió en la décima parte del volumen
inicial de la solución amortiguadora, adicionando Triton
X-100 al 2% (v/v) y agitando por 2 h. La suspensión se
clarificó por centrifugación a 3.000 rpm por 5 min,
y posteriormente se concentró mediante
ultracentrifugación (40.000 rpm por 2 h).

El patógeno a identificar resuspendido se
sometió a centrifugación en un gradiente de
densidad de
sacarosa (20-50%) a 32.000 rpm por 5 h. Las bandas visibles se
recobraron de los gradientes con una aguja hipodérmica y
se concentraron mediante ultracentrifugación. El
patógeno se resuspendió en KPO4 0,001 M, pH 7,5.
Las observaciones del agente aislado se realizaron en un microscopio
electrónico JEOL SX-100 del Centro Regional La Platina del
INIA.

Se realizaron pruebas de
patogenicidad en invernadero bajo condiciones controladas de
temperatura(22-24ºC) en el Centro
Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), inoculando
mecánicamente 14 variedades de frejol (Phaseolus vulgaris
L.), utilizadas comúnmente como diferenciales para otros
virus de
frejol, y las diferentes especies que se indican mas adelante.
Variedades de frejol: Black Turtle Soup, Blue Lake, Bountiful,
Great Northern 31, Great Northern 123, Kentucky Wonder, Kentucky
Wonder Wax, Michelite 62, Monroe, Pinto 78, Pinto 114, Red Kidney, Tendergreen y
Topcrop; las especies Phaseolus acutifolius var. latifolius,
arveja (Pisum sativum) variedades Alaska y Little Marvel, soya
(Glycine max) variedad ICA L 121, Lablab purpureus, Vigna
aconitifolia, V. radiata, V. umbellata, caupí (Vigna
unguiculata), Chenopodium amaranticolor, C. murale, C. quinoa,
Datura stramonium, Gomphrena globosa, Capsicum sp., Nicotiana
benthamiana, N. glutinosa, N. tabacum variedades Samsun y White
Burley.

Se preparó un antisuero en los laboratorios del
Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), mediante la
inmunización de un conejo de raza Nueva Zelanda, con
cuatro inyecciones de 0,5 mL de suspensión viral (A
260/280 = 1.58) a una concentración de 1 mg ml-1,
emulsionada con adyuvante completo de Freund (primera
inyección) o incompleto (inyecciones subsecuentes). La
primera sangría se realizó una semana
después de la cuarta inyección. La prueba de ELISA
se realizó según el método de Clark y Adams
(1977).

Se realizaron dos prospecciones en la zona productora de
frejol en Chile, la cual se extiende de la V a la VIII
Región, durante las temporadas de 1993/1994 y 1995/1996.
Se colectaron un total de 173 muestras en campos de frejol
seleccionados al azar, tomando muestras de plantas de frejol
afectadas por diferentes síntomas de posible
etiología viral. Las localidades muestreadas fueron:
Colina, Nogales, Santiago, Los Tilos, Graneros, Rancagua, San
Fernando, Curico, San Carlos, Chillán, Renaico y Los
Angeles; se colectaron frejoles tipo tortola, coscorron , Apolo y
variedades de frejol negro. Se tomaron también muestras de
alfalfa (Medicago sativa L.) y trébol rosado (Trifolium
pratense L.) con síntomas de amarillamiento intenso,
similar al observado en frejol, en campos de la localidad de
Graneros (VI Región). Todas estas muestras se sometieron a
la prueba de ELISA con el antisuero preparado en los laboratorios
del Centro Internacional de Agricultura Tropical. Como testigo se
utilizó hojas de plantas de frejol sanas.

Resultados

La observación de la suspensión
purificada en el microscopio electrónico de
transmisión, reveló la presencia de
partículas virales polimórficas
características del AMV (Figura 1). El proceso de
purificación produjo aproximadamente 6,0 mg de virus por
cada 100 g de tejido de frejol infectado. La inmunización
de animales de
laboratorio
produjo un antisuero de alta especificidad, según los
resultados obtenidos en la prueba de ELISA, la cual arrojó
valores (A405
nm) para las muestras infectadas por el AMV, 50-100 veces
superiores a los valores
observados para los controles de tejido de frejol libre de
virus.

Figura 1. Particulas del virus del
mosaico de la alfalfa purificado a partir de frejol. Aumento
40.000 veces.
Figure 1. Particles of alfalfa mosaic virus purified from common
bean plants. 40.000 times size.

Todas las variedades de frejol inoculadas se comportaron
como susceptibles al AMV y manifestaron síntomas
sistémicos, principalmente un amarillamiento o punteado
amarillo, seguido por diversos grados de deformación,
clorosis y, en algunas variedades, necrosis localizada. Las otras
leguminosas inoculadas también mostraron síntomas
de infección viral sistémica, presentándose
el amarillamiento característico en arveja, L. purpureus,
V. aconitifolia y V. unguiculata. La variedad de soya inoculada
mostró clareamiento de nervaduras, y V. radiata
reaccionó con necrosis sistémica.

De las especies de otras familias inoculadas con el
virus, C. amaranticolor y C. quinoa se infectaron
sistémicamente, presentando amarillamiento, C. murale no
mostró síntomas, Capsicum sp., D. stramonium y G.
globosa también mostraron amarillamiento. Las variedades
inoculadas de Nicotiana, con la excepción de N.
benthamiana, presentaron clorosis de nervaduras, manchas
amarillas y deformación foliar.

Los resultados obtenidos de la prospección
realizada durante la temporada 1993/1994, mostraron que el AMV se
presentó en siembras de frejol de la V y VI Regiones. En
esta última región el virus se encontró
afectando frejol de la variedad Coscorrón. Las muestras
positivas representaron aproximadamente un 2% del total de
muestras analizadas. En la siguiente prospección realizada
en la temporada 1995/1996, el AMV se detectó en dos
localidades de la VIII Región, Los Angeles y Renaico,
afectando variedades de frejol de grano negro; estas muestras
positivas representaron aproximadamente un 4% del total de
muestras analizadas. Las muestras de alfalfa y trébol
tomadas en la localidad de Graneros (VI Región),
también resultaron positivas para el AMV en las pruebas de
ELISA realizadas.

Discusión

Las pruebas realizadas en esta investigación,
confirmaron la presencia del virus de AMV en alfalfa y frejol en
Chile (Sepúlveda, 1992; Morales, F. (CIAT, información no publicada). En frejol, se
reporta como característica diagnóstica, la
presencia de lesiones locales necróticas o
cloróticas en las hojas inoculadas. En este estudio, 13 de
las 14 variedades de frejol inoculadas, mostraron lesiones
locales en las hojas primarias inoculadas. La variedad
Tendergreen no mostró lesiones locales. La arveja es otra
especie considerada de valor diagnóstico, pero una de las dos variedades
inoculadas en este estudio se comportó como resistente; la
especie P. acutifolius podría ser utilizada con fines de
diagnóstico para detectar AMV, ya que sólo presenta
lesiones locales. También sería útil V.
radiata, puesto que reacciona con necrosis sistémica.
Dentro de las especies en otras familias, C. murale se
comportó como inmune, mientras que C. amaranticolor y C.
quinoa mostraron lesiones locales e infección
sistémica, lo cual también tendría valor
diagnóstico. A pesar de que las especies de Nicotiana son
utilizadas en el diagnóstico del AMV (Van Vloten, 1990),
en este estudio presentaron síntomas locales y
sistémicos, al igual que N. glutinosa. Curiosamente, N.
benthamiana, considerada una de las especies de tabaco más
susceptibles al virus, se comportó como inmune al AMV
chileno, probablemente por tratarse de un aislamiento
diferente.

Las prospecciones realizadas indicaron que el AMV se
encontró distribuido en toda el área productora de
frejol de Chile. Afortunadamente, su incidencia es baja, en
relación con otros virus del frejol presentes en Chile,
como es el virus del mosaico común y el virus del mosaico
amarillo del frejol. El AMV, sin embargo, ha sido aislado de
cultivos de haba en Chile (Sepúlveda, 1992), y dentro de
sus hospederos naturales se encuentran alfalfa (Medicago sativa),
lenteja (Lens culinaris), papa (Solanum tuberosum), pimiento
(Capsicum annuum) y tomate
(Lycopersicon esculentum), cultivos de importancia
económica en Chile.

Los principales medios de
transmisión del AMV son áfidos y la semilla de
alfalfa, pero se conocen otras especies vegetales que
también transmiten el AMV por semilla, incluyendo al
frejol (Kaiser y Hannan, 1983). Sin embargo, estudios
preliminares realizados por la autora principal (no publicados)
han demostrado que el virus no se transmite en forma importante
por semilla en variedades chilenas de frejol. Tomando en cuenta
que el AMV es un virus endémico en el país, es
importante realizar prospecciones frecuentes en las regiones
productoras del país, con el fin de prevenir la
diseminación de cepas del AMV adaptadas al
frejol.

Conclusiones

Los estudios realizados permitieron confirmar la
presencia del virus del mosaico de la alfalfa en las regiones
productoras de frejol de Chile.

El procedimiento
descrito junto con la utilización de antisuero es el
método adecuado y propuesto para la detección e
identificación de AMV.

El virus del mosaico de la alfalfa presentó baja
incidencia en las dos temporadas en estudio en comparación
con los otros virus que afectan frejol.

Literatura citada

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alfalfa mosaic virus pathogens of bean in Emilia Romagna. Inf.
Fitopatol. 41: 50-53.

Clark, M.F., and A.N. Adams. 1977. Characteristics of
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the detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 34:
475-484.

Edwardson, J.R., and R.G. Christie. 1991. Handbook of
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Florida, USA.

Guillaspie, A.G., and J.B. Bancroft. 1965. Properties of
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components. Virology 27: 391-397.

Kaiser, W.J., and R.M. Hannan. 1983. Additional hosts of
alfalfa mosaic virus and its seed transmission in tumble pigweed
and bean. Plant Dis. 67: 1354-1357.

Lisa, V., A.M. Vaira, and G. Dellavalle. 1990. Alfalfa
mosaic virus in bean in Piedmont. Inf. Fitopatol. 40:
47-48.

Schmidt, H.E. 1981. The diagnosis of viruses of legume
crops in the German Democratic Republic as a prerequisite for
breeding broad bean, bean, pea and lupin for resistance to virus
diseases. p. 25-33. In Principles of Plant Resistance to Diseases
and Pests. Inst. Plant Prot., Bucharest, Romania.

Sepúlveda, P. 1992. Determinación del
virus del mosaico de la alfalfa en haba y frejol en Chile.
Simiente 62: 213 (Resumen).

Thomas, H.R.. 1951. Yellow dot, a virus disease of bean.
Phytopathology 41: 967-974.

Tu, J.C. 1989. Isolation and characterization of
biological agents causing discoloration in Ontario-produced navy
beans. Mededelingen-van-den-Faculteit-Landbouwwetenschappen,
Rijksuniversiteit, Gent. 54: 567-571.

Van Vloten, L. 1990. Alfalfa mosaic virus. p. 71-75 In
A. Brunt, K. Crabtree and A. Gibbs (eds.), Viruses of Tropical
Plants. C.A.B. International, Oxon, United Kingdom.

Publicación original: Agric.
Téc. [online]. jul. 2001, vol.61, no.3 [citado 11 Junio
2007], p.379-384.
Disponible en la World Wide
Web:

ISSN 0365-2807.
Reproducción autorizada por: Revista
Agricultura Técnica, hriquelm[arroba]inia.cl

Paulina Sepúlveda R.3, Francisco
Morales3, Mauricio
Castaño3

1. Recepción de originales: 12 de julio de
2000.
2 Instituto de Investigaciones
Agropecuarias, Centro Regional de Investigación La
Platina, Casilla 439 – 3, Santiago, Chile.

3. Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), Apartado
Aéreo 6713, Cali, Colombia. E-mail:
.